Medycyna Wieku Rozwojowego, 2009,XIII,1; 66-70

Ekspresja KIR-NKAT2 i zdolność tworzenia monocytoidalnych komórek dendrytycznych u dzieci diagnozowanych w kierunku zaburzeń odporności – doniesienie wstępne

Jan Styczyński, Sylwia Kołtan, Robert Dębski, Elżbieta Grześk, Andrzej Kołtan, Małgorzata Kubicka, Beata Rafińska-Kuryło, Beata Kołodziej, Mariusz Wysocki


Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii,
Collegium Medicum w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja Kopernika,
Kierownik: prof. dr hab. med. M. Wysocki

  • Ryc. 1. Urządzenie Super-MACS do immunomagnetycznej selekcji komórek
  • Ryc. 2. Komórki NK (CD16+CD56) w badaniu cytometrycznym przed i po selekcji immunomagnetycznej na Super-MACS
  • Ryc. 3. Wzrost ekspresji CD83 i CD206 w 7 i w 14 dobie hodowli monocytów, określany średnią intensywnością fluorescencji
  • Tabela I. Ekspresja KIR-NKAT2 i wzrost ekspresji antygenów komórek dendrytycznych u pacjentów po splenektomii i bez splenektomii
  • Tabela II. Ekspresja KIR-NKAT2 i wzrost ekspresji antygenów komórek dendrytycznych u pacjentów z obecnymi zaburzeniami odporności i bez stwierdzonych zaburzeń

Wstęp: Receptor KIR-NKAT2 (killing immunoglobulin-like receptor) obecny na naturalnych komórkach cytotoksycznych (NK; natural killer) powoduje rozpoznawanie antygenów zgodności tkankowej C (HLA-C) na komórkach zainfekowanych różnymi typami wirusów. Jego obecność może więc utrudniać eliminację tych komórek i sprzyjać przewlekaniu się infekcji. Innym niezależnym i słabo poznanym pa-rametrem świadczącym o sprawności układu immunologicznego może być zdolność monocytów do tworzenia komórek dendrytycznych.

Cel pracy:
Uzyskanie odpowiedzi na pytanie, czy przyczyną częstych infekcji u dzieci bez wykrytych niedoborów odporności lub po przebytej splenektomii może być zaburzona ekspresja KIR-NKAT2 oraz określenie zdolności monocytów do tworzenia komórek dendrytycznych.

Pacjenci i metody: Badania przeprowadzono u 38 dzieci diagnozowanych w kierunku zaburzeń odporności (nawracające infekcje, pacjenci po splenektomii, niedobory składowych układu dopełniacza). Z krwi obwodowej izolowano komórki jednojądrzaste. Za pomocą separatora Super-MACS dokonano selekcji monocytów oraz komórek NK. Na komórkach NK oceniano ekspresję KIR-NKAT2 metodą cytometrii przepływowej. Wyizolowane monocyty poddano 14-dniowej hodowli na wzbogaconym podłożu Methocult, w celu uzyskania transformacji do komórek dendrytycznych i oceniano ekspresję CD83 i CD206.

Wyniki: U 31/38 pacjentów stwierdzono ekspresję KIR-NKAT2. Monocyty 37/38 pacjentów po 7 dniach hodowli wytwarzały komórki dendrytyczne, chociaż obserwowano zróżnicowaną intensywność tego procesu. U pacjentów po splenektomii obserwowano trend do wyższej ekspresji KIR-NKAT2 oraz do słabszego tworzenia komórek dendrytycznych. Nie stwierdzono natomiast związku badanych parametrów z innymi rodzajami zaburzeń odporności.

Wnioski: Wyniki badań mogą sugerować, że defekt odporności wrodzonej, mogący wynikać zarówno z nieprawidłowej funkcji komórek NK w następstwie zaburzonej ekspresji receptorów KIR-NKAT2 jak i upośledzonej zdolności monocytów do tworzenia komórek dendrytycznych, nie jest odpowiedzialny za zwiększoną skłonność dzieci do infekcji. Splenektomia jest natomiast istotnym elementem zaburzającym mechanizmy immunologiczne, prawdopodobnie także w zakresie analizowanych parametrów. Problem wymaga jednak dalszych badań.

WSTĘP

Choroby o charakterze pierwotnych niedoborów immunologicznych są stosunkowo często stwierdzane w populacji dziecięcej. Mają one charakter zaburzeń komórkowych, humoralnych oraz kombinowanych. Najczęstszymi patologiami są selektywne niedobory immunoglobulin. Istnieje jednak grupa dzieci, które chorują częściej aniżeli ich zdrowi rówieśnicy, a nie wykryto u nich żadnego zdefiniowanego defektu odporności, ani innych czynników sprzyjających infekcjom. Być może przyczyną zwiększonej skłonności do zakażeń jest niezidentyfikowany defekt odporności nieswoistej (wrodzonej), która stanowi pierwszą barierę obronną organizmu. Spośród komórek biorących udział w reakcjach odporności nieswoistej stosunkowo słabo poznane są naturalne komórki cytotoksyczne (NK) oraz monocyty. Pojawianie się nowych technologii medycznych pozwala bardziej precyzyjnie wyjaśnić mechanizmy immunologiczne, a tym samym poprawić możliwości terapeutyczne. Od niedawna prowadzone są badania nad receptorami killing immunoglobulin-like receptor (KIR), odgrywającymi ważną rolę w regulacji aktywności komórek NK. Wśród receptorów KIR są zarówno receptory aktywujące i hamujące. Aktywacja NK jest wypadkową oddziaływań pomiędzy poszczególnymi receptorami (nie tylko KIR) i ich ligandami. W uproszczeniu, mechanizmy te mają z jednej strony chronić zdrowe komórki gospodarza, z drugiej – doprowadzić do zniszczenia komórek zmienionych w przebiegu zakażenia wirusowego lub nowotworowo (1). Receptor KIR-NKAT2 obecny na komórkach NK powoduje rozpoznawanie antygenów zgodności tkankowej typu C (HLA-C), który jest jego ligandem. Brak lub osłabienie ekspresji HLA-C na komórkach zakażonych wirusem lub zmienionych nowotworowo skutkować powinien aktywacją komórek NK i zniszczeniem nieprawidłowych komórek.

Innym niepoznanym mechanizmem odporności nieswoistej, który może ulegać zmianie w stanach chorobowych, jest zdolność monocytów do transformacji w kierunku komórek dendrytycznych.

Celem pracy było znalezienie odpowiedzi na pytanie, czy przyczyną częstych infekcji u dzieci bez wykrytych niedoborów immunologicznych lub po przebytej splenektomii może być zaburzona ekspresja KIR-NKAT2 oraz zdolność monocytów do tworzenia komórek dendrytycznych.

PACJENCI I METODYKA

Izolacja komórek jednojądrzastych

Badania przeprowadzono u 38 dzieci (19 chłopców, 19 dziewcząt) w wieku 1-17 lat (mediana 10 lat) diagnozowanych w kierunku zaburzeń odporności (najczęściej z powodu nawracających infekcji). Do zaburzeń odporności zaliczono: hipogammaglobulinemię, stan po splenektomii, niedobór składowej C3 lub C4 dopełniacza, przewlekła kandydoza jamy ustnej, niedobór komórek CD19, niedobór komórek CD4 lub CD8. Od pacjentów pobierano 5 ml krwi obwodowej i izolowano komórki jednojądrzaste na gradiencie stężeń (Gradisol L, Aqua-Medica, Łódź). Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej.

Immunoselekcja magnetyczna komórek NK*

Za pomocą separatora SuperMACS II (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Niemcy) (ryc. 1), przy użyciu kulek magnetycznych dokonano magnetycznej izolacji i selekcji monocytów w następujący sposób: 100 µl zawiesiny komórek jednojądrzastych zawieszano w 300 µl buforowanego PBS (z dodatkiem 0,5% surowicy cielęcej płodowej (Gibco) i 2mM EDTA (Sigma o wartości pH 7,2). Do zawiesiny dodawano 100 µl FcR Blocking Reagent w celu zahamowania niespecyficznego wiązania przeciwciał z kulkami magnetycznymi do innych komórek. Komórki były znakowane przez dodanie 100 µl NK MACS MicroBeads (Miltenyi Biotec) 500 µl. Zawiesinę mieszano i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 4°C. Komórki płukano w buforze i wirowano w 300 g przez 10 minut. Usuwano supernatant i zawiesinę resuspendowano w 500 µl buforu. Do magnetycznej izolacji komórek użyto kolumn MS Column (Miltenyi Biotec) na SuperMACS II (Miltenyi Biotec). Po przepłukaniu kolumny buforem, umieszczono 500 µl zawiesiny komórkowej w kolumnie. Komórki niezwiązane z kulkami magnetycznymi (tzw. frakcja negatywna) wypływały swobodnie przez kolumnę, natomiast w kolumnie pozostawały komórki związane z kulkami (tzw. frakcja pozytywna). Kolumna była przepłukiwana buforem, a następnie usuwana z pola magnetycznego i umieszczana nad probówką kolekcyjną. Kolejne przepłukanie kolumny powodowało wypływ komórek związanych z biodegradowalnymi kulkami magnetycznymi. W tej frakcji komórkowej znajdowały się komórki NK. Czystość selekcji komórek NK oceniano metodą cytometrii przepływowej (ryc. 2).

Analiza receptorów KIR-NKAT2

Na komórkach NK oceniano ekspresję killing inhibitory receptor, KIR-NKAT2 metodą cytometrii przepływowej (anti-KIR-NKAT2-FITC, Becton Dickinson). W analizie ilościowej zastosowano parametr średniej intensywności fluorescencji.

Immunoselekcja magnetyczna monocytów

Izolację monocytów przeprowadzano w sposób analogiczny jak izolację komórek NK (ryc. 2) stosując kulki CD14 MACS MicroBeads (Miltenyi Biotec). Czystość selekcji monocytów oceniano metodą cytometrii przepływowej.

Transformacja komórek dendrytycznych monocytoidalnych

Wyizolowane monocyty poddano 14-dniowej hodowli na płytkach 12-dołkowych (Beton Dickinson, San Diego, USA) na wzbogaconym podłożu Methocult (Stem Cell Technologies, Tominex, Wrocław), w celu transformacji do komórek dendrytycznych, których obecność badano metodą cytometrii przepływowej w kierunku obecności CD83 i CD206 przeciwciałami anti-CD83-FITC i anti-CD206-RPE (Becton Dickinson) (ryc. 3). Analizę przeprowadzono na cytometrze FC500 (Beckman-Coulter, Miami, Floryda, USA).

WYNIKI


U 31/38 pacjentów stwierdzono obecność receptora KIR-NKAT2 o zróżnicowanej ekspresji. Monocyty u 37/38 pacjentów, po 7 dniach hodowli, wytwarzały komórki dendrytyczne, chociaż obserwowano zróżnicowaną intensywność tego procesu. Zdolności do wytwarzania komórek dendrytycznych nie wykazywał pacjent diagnozowany z powodu częstych infekcji układu oddechowego, bez stwierdzanego deficytu immunologicznego w zakresie odporności komórkowej i humoralnej.

U pacjentów po splenektomii obserwowano trend do wyższego odsetka komórek z ekspresją KIR-NKAT2 (1,12% vs 0,65%, p=0,072, test Mann-Whitney) oraz do słabszego tworzenia komórek dendrytycznych, wyrażonego wzrostem ekspresji antygenu CD83 (2,4-krotnie vs 3,8-krotnie, p=0,085) i wzrostem ekspresji antygenu CD206 (5,4-krotnie vs 6,9-krotnie, p=0,094, test Mann-
-Whitney) (tab. I). Nie wykazano natomiast różnic badanych parametrów pomiędzy podgrupami pacjentów w zależności od stwierdzanych zaburzeń odporności (tab. II).

DYSKUSJA

Częstym problemem klinicznym, przyczyniającym się do pogorszenia jakości życia dzieci są częste infekcje. Są one nierzadko powodem absencji jednego z rodziców w pracy, co przekłada się na wymierne problemy ekonomiczne. Nie zawsze badania wykazują defekt immunologiczny wrodzony lub nabyty, bądź też wykrywają inne czynniki sprzyjające zakażeniom. Nie wszystkie jednak elementy układu odporności oceniane są w praktycznie stosowanych algorytmach diagnostycznych. Dotyczy to także komórek wrodzonej (nieswoistej) odporności. Jednocześnie w niektórych przypadkach zaburzeń immunologicznych obserwuje się obraz kliniczny nie korelujący ze stwierdzanymi zaburzeniami komórkowymi lub humoralnymi. Sugeruje to, że możliwa jest częściowa kompensacja jednego rodzaju zaburzeń ze strony innych elementów układu immunologicznego. Z drugiej strony, dzięki nowym technologiom, możliwe jest wykrycie bardziej złożonych zaburzeń immunologicznych.

W analizowanym piśmiennictwie brak jest danych dotyczących receptorów KIR i ich znaczenia dla prawidłowej funkcji komórek NK zarówno u dzieci bez wykrytych zaburzeń jak i ze stwierdzonymi niedoborami odporności, a zaledwie pojedyncze badania oceniają rolę i funkcję komórek dendrytycznych u chorych z niedoborami immunologicznymi. Dokładne poznanie tych funkcji może stworzyć nowe możliwości terapeutyczne. Dlatego jednym z pytań, które zadali sobie autorzy pracy, było: czy przyczyną częstych infekcji u dzieci bez wykrytych niedoborów immunologicznych może być zaburzona funkcja receptorów KIR lub zdolności monocytów do tworzenia komórek dendrytycznych? Uzyskane wyniki sugerują, iż tak nie jest, wymaga to jednak badań w większej grupie dzieci.

Drugim zagadnieniem było, czy w zdiagnozowanych niedoborach ulega także zaburzeniu funkcja komórek NK i monocytów. W ostatnim okresie pojawiły się pierwsze doniesienia dotyczące roli receptorów KIR obecnych na komórkach NK (2). Celem prezentowanej pracy nie było określenie ekspresji KIR w poszczególnych zaburzeniach odporności, lecz ewentualne wychwycenie niedoboru immunologicznego, w którym ta ekspresja jest w jakiś sposób zaburzona. To byłoby podstawą do zaplanowania badań tego parametru w większej grupie dzieci. Uzyskane wyniki sugerują, iż taką grupą mogą być chorzy po splenektomii, gdyż tylko u nich wykazano wyższą ekspresję KIR. Nie jest to zaskakujące. W najnowszych opracowaniach Theodorou i wsp. (3), przedstawiono wyniki analizy subpopulacji limfocytów we krwi obwodowej u chorych co najmniej rok po splenektomii, przeprowadzanej z powodu jej urazowego pęknięcia i odnoszono je do chorych leczonych zachowawczo oraz zdrowych. Wykazano, iż pacjenci z asplenią mieli znaczący wzrost liczby bezwzględnej i aktywności komórek NK. Wg autorów może to być następstwem kompensacji braku aktywności fagocytarnej w śledzionie, z drugiej jednak strony może sprzyjać rozwojowi powikłań takich jak przewlekłe nadciśnienie płucne. W cytowanej pracy nie analizowano ekspresji receptorów KIR, wśród których są zarówno receptory hamujące jak i aktywujące. Nie jest jednak wykluczone, iż w parze ze wzrostem liczby bezwzględnej NK idzie wzrost ekspresji np. receptorów KIR.

W badaniach Fontany i wsp. (4) u pacjentów z zespołem hyper-IgM wykazano zaburzenia funkcji komórek dendrytycznych pochodzenia monocytarnego oraz zaburzenia funkcji limfocytów T. Zaburzenia czynności komórek dendrytycznych pochodzenia monocytarnego obserwowano również u pacjentów z zespołem LAD-1 (leukocyte adhesion deficiency) (5). Z kolei Gagliardi i wsp. (6) obserwowali prawidłową funkcję komórek dendrytycznych pochodzenia mieloidalnego u pacjentów z zespołem Brutona (X-linked agammaglobulinemia). W analizowanej grupie jedynie u chorych po splenektomii stwierdzono mniejszą zdolność do tworzenia komórek dendrytycznych. Wymaga to jednak dalszych badań.

Podsumowując, u większości diagnozowanych dzieci stwierdzono ekspresję KIR-NKAT2, receptora, dla którego ligandem jest HLA-C. Jednocześnie monocyty prawie wszystkich pacjentów wykazywały zdolność tworzenia komórek dendrytycznych, chociaż o różnym nasileniu przemiany. U pacjentów po splenektomii badane parametry wykazują większe zaburzenia. Konieczne są jednak dalsze badania.

WNIOSKI

1.    Defekt odporności wrodzonej, mogący wynikać zarówno z nieprawidłowej funkcji komórek NK w następstwie zaburzonej ekspresji receptorów KIR-NKAT2 jak i upośledzonej zdolności monocytów do tworzenia komórek dendrytycznych, nie jest odpowiedzialny za zwiększoną skłonność do infekcji.

2.    Splenektomia jest istotnym czynnikiem zaburzającym mechanizmy immunologiczne, prawdopodobnie także w zakresie analizowanych parametrów, konieczne jest jednak dalsze prowadzenie badań w tym zakresie.

..............................................................................................................................................................

*Separacje komórkowe i wszystkie analizy cytometryczne były wykonane w Pracowni Onkologii Klinicznej i Eksperymentalnej, Kliniki Pediatrii, Hematologii i Onkologii CM.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Lanier L.L.: NK cell recognition. Annu. Rev. Immunol., 2005, 23, 225-274.

2.    Gazit R., Garty B.Z., Monselise Y., Hoffer V., Finkelstein Y., Markel G., Katz G., Hanna J., Achdout H., Gruda R., Gonen-Gross T., Mandelboim O.: Expression of KIR2DL1 on the entire NK cell population: a possible novel immunodeficiency syndrome. Blood, 2004, 103, 1965-1966.

3.    Theodorou G.L., Mouzaki A., Tsiftsis D., Apostolopoulou A., Mougiou A., Theodori E., Vagianos C., Karakantza M.: Effect of non-operative management (NOM) of splenic rupture versus splenectomy on the distribution of peripheral blood lymphocyte populations and cytokine production by T cells. Clin. Exp. Immunol., 2007, 150, 429-436.

4.    Fontana S., Moratto D., Mangal S., De Francesco M., Vermi W., Ferrari S., Facchetti F., Kutukculer N., Fiorini C., Duse M., Das P.K., Notarangelo L.D., Plebani A., Badolato R.: Functional defects of dendritic cells in patients with CD40 deficiency. Blood, 2003, 102, 4099-4106.

5.    Fiorini M., Vermi W., Facchetti F., Moratto D., Alessandri G., Notarangelo L., Caruso A., Grigolato P., Ugazio A.G., Notarangelo L.D., Badolato R.: Defective migration of monocyte-derived dendritic cells in LAD-1 immunodeficiency. J. Leukoc. Biol., 2002, 72, 650-656.

6.    Gagliardi M.C., Finocchi A., Orlandi P., Cursi L., Cancrini C., Moschese V., Miyawaki T., Rossi P.: Bruton’s tyrosine kinase defect in dendritic cells from X-linked agammaglobulinaemia patients does not influence their differentiation, maturation and antigen-presenting cell function. Clin. Exp. Immunol., 2003, 133, 115-122.

..............................................................................................................................................................

Adres do korespondencji:

Jan Styczyński

Katedra i Klinika Pediatrii,
Hematologii i Onkologii,
Collegium Medicum
im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy,
Uniwersytet im. Mikołaja Kopernika
ul. Curie-Skłodowskiej 9, 85-094 Bydgoszcz
tel. (+52) 585-48-60, fax (+52) 585-48-67
jstyczynski@cm.umk.pl